上一次，小編帶大家一起看了兩棲動物蠑螈神奇的斷肢再生。那么，是否有水生動物也具有強大的再生能力呢？今天就為各位老師分享一篇關于斑馬魚心臟再生的單細胞&時空組學文章。
發表期刊：Nature Genetics
發表單位：柏林醫學系統生物學研究所
影響因子：41.307
發表時間：2022.07.21
DOI號：10.1038/s41588-022-01129-5
研究背景
成年哺乳動物的心臟損傷通常會導致永久性瘢痕。然而，成年斑馬魚心臟損傷后能有效再生，這使得斑馬魚成為研究心臟再生細胞和分子機制的理想模型。在模擬心肌梗塞的低溫損傷后，受傷的斑馬魚心臟會經歷一個短暫的纖維化期。在此期間，受損的心肌會通過去分化和增殖進行再生，這與心肌梗死的某些方面相似。然而，在以往的斑馬魚心臟再生研究中，還沒有系統的數據來確定再生細胞的狀態和細胞類型的起源，對再生生態位的細胞組成、潛在的信號傳遞和相互作用的認識仍不全面。目前對活化巨噬細胞和成纖維細胞的定義嚴重依賴于轉基因，可能受到觀察偏差的影響，從而低估斑馬魚心臟再生過程中細胞狀態的復雜性。
材料方法
單細胞RNA-seq ：
表1 實驗樣本一覽表
空間轉錄組（Tomo-seq）：斑馬魚心房和心室一共100張切片，每張切片分別做RNA-seq
方法：scRNA-seq、Tomo-seq、熒光原位雜交和基于CRISPR-Cas9技術的譜系追蹤
研究結果
為了系統地識別健康和再生斑馬魚心臟中的細胞類型，作者對損傷前后不同階段的大約20萬個解離細胞進行了scRNA-seq（圖1a）。為了準確得到細胞發育起源的相關信息，作者還應用了一種基于CRISPR–Cas9技術的大規模平行譜系追蹤方法，通過注射Cas9和針對多拷貝轉基因(斑馬魚系中的dTomato：一種用于斑馬魚細胞追蹤和譜系分析的多光譜細胞標記)的sgRNA，創建了作為譜系條形碼的“遺傳疤痕”來記錄早期發育中的譜系關系。
作者首先評估了健康和再生心臟中的細胞類型多樣性，單細胞轉錄組的聚類分析顯示了所有主要的心臟細胞類型。正如預期的那樣，觀察到成纖維細胞和免疫細胞在損傷后強烈增加（圖1b）。進一步檢查聚類數據發現，心臟的三個主要層:心外膜、心肌和心內膜的細胞類型之間存在一個亞結構。作者假設，由于心房和心室中這些細胞類型的功能差別，這種細胞類型的亞結構可能存在空間差異。于是使用Tomo-seq方法（一種用冷凍切片機沿感興趣的軸對組織進行切片，然后在每個切片上進行RNA-seq的技術）進行空間分辨率轉錄組，并將空間數據解卷積為單細胞轉錄譜，可以驗證一些細胞亞型在心房和心室富集（圖1c）。之后再通過物理分離心房和心室，使用scRNA-seq證實了這一發現（圖1d）。
圖1?再生心臟的細胞組成
作者進一步確定了心肌細胞中的一個轉錄亞結構（圖2a）。除了以表達ATP合成和三羧酸循環相關基因(atp5pd和aldoaa)為特征的成年心肌細胞外，還檢測到一個較小的與心肌細胞發育相關的基因簇(ttn.1, ttn.2,?bves and synpo2lb)，以及nppa——此前已被證明是邊界區去分化心肌細胞的標記基因。這些去分化心肌細胞是心臟再生的標志，其數量在3 d.p.i.（受傷后天數）增加了(圖2a)，并與已建立的標記基因nppa22部分共定位于7 d.p.i.。
作者注意到心臟再生中三個成熟的信號因子在成纖維細胞中高度富集:合成視黃酸的酶aldh1a2、心肌細胞有絲分裂原nrg1和再生細胞外基質(ECM)因子fn1a（圖2b）。為了更詳細地研究心臟成纖維細胞的多樣性，作者對成纖維細胞進行了亞群聚類。結果顯示出驚人的多樣性，有13個轉錄上不同的成纖維細胞聚類(圖2c)。這13個基因簇在ECM相關基因的表達譜上表現出明顯的差異（圖2d），但它們的轉錄組多樣性遠不止于此——去除ECM相關基因后，可以高精度鑒定相同的成纖維細胞亞型。
圖2?心臟成纖維細胞的細胞類型多樣性
3. 心臟再生成纖維細胞的鑒定
為了集中分析那些可能是再生生態位一部分的成纖維細胞亞型，作者分析了損傷后細胞簇的動力學。col11a1a、col12a1a和nppc特征表達的3簇成纖維細胞在再生高峰期短暫出現?(3、 7 d.p.i.)，但在受傷前和再生完成后幾乎不存在。由于其短暫性，作者將這三個基因簇稱為細胞狀態，而不是細胞類型（圖3a）。為了對鑒定的成纖維細胞進行空間分辨，作者進行了熒光原位雜交證實了瞬時成纖維細胞狀態在邊界區以及損傷區的位置（圖3b）。之后發現nrg1在col12a1a成纖維細胞中特別高的表達，而fn1a幾乎只在col11a1a成纖維細胞中表達（圖3c）。作者推斷瞬時細胞狀態的潛在再生功能可能是由分泌因子驅動的。生物信息學分析顯示，與未損傷的對照組心臟相比，再生心臟的分泌組基因表達在3 d.p.i.和7 d.p.i.時增加（圖3d）。col11a1a和col12a1a成纖維細胞中分泌組基因的表達在所有檢測到的細胞簇中最高，且其分泌組基因包含在再生、形態發生和組織發育等方面具有功能的基因（圖3e）。
雖然作者對單細胞基因表達譜的時空分析強烈表明了瞬時成纖維細胞的再生功能，但還需要額外的實驗來驗證這一假設。為了從功能上評估瞬時col11a1a和col12a1a成纖維細胞的作用，作者使用硝基還原酶/甲硝唑（NTR/MTZ）系統進行靶向細胞剔除。在MTZ處理后的轉基因系Tg(-4kbcol12a1a:GAL4VP16;UAS:NTR:RFP)中，在7 d.p.i.時相較于對照，5 / 6的心臟顯示心肌細胞增殖減少，col12aa表達細胞減少（圖3g,h）。在30d.p.i.時，col12a1+細胞剔除顯著損害心臟再生（圖3i,j）。總之，作者確定了心臟再生過程中具有潛在再生作用的三種成纖維細胞狀態:col11a1a、col12a1a和nppc成纖維細胞。基因細胞剔除數據強烈表明col12a1a表達細胞在再生生態位中發揮了作用。
圖3?心臟再生成纖維細胞的鑒定
4. 心外膜成纖維細胞的鑒定
接下來，作者想要闡明短暫成纖維細胞狀態的起源，以便更好地理解它們的激活機制。于是作者使用了基于CRISPR-Cas9技術的大規模平行譜系追蹤方法LINNAEUS。這種方法將細胞通過可遺傳的DNA條形碼(遺傳疤痕)標記，它們由Cas9在早期發育過程中產生，其獨特的序列能夠識別疤痕產生時來自同一親本的細胞。通過對同一個單細胞的遺傳疤痕和轉錄組進行測序，作者便可以建立譜系樹，揭示這些細胞類型的共同發育起源（圖4a）。在譜系樹中，一個節點中的所有細胞共享相同的發育祖先（比如圖4a，B和C節點就共享相同發育祖先A），并且每個節點上不同瞬時細胞狀態下的每個細胞均可在相同的上一節點中對應找到（比如在圖4a的譜系圖中節點C就包含了3種瞬時細胞狀態，這三種狀態下的所有細胞均可以在上一節點的對應細胞狀態中找到）。作者還計算了不同樹節點中細胞類型比率之間的相關性，以確定哪些細胞類型通過譜系相關聯（圖4b）。譜系相關性聚類熱圖顯示，在3 d.p.i.時有4簇細胞類型，在7 d.p.i.時有7簇細胞類型。在這兩個時間點，所有的免疫細胞共享一個相同的譜系。此外，幾種成纖維細胞：col11a1a、col12a1a和構成型成纖維細胞，它們和心外膜細胞聚集在一起，這表明這些成纖維細胞與心外膜細胞具有共同的發育起源（圖4c,d）。為了驗證這一結論，作者又構建了轉基因系TgBAC(tcf21:Cre-ERT2;ubi:Switch)。重組后，在7 d.p.i.表達的mCherry與內源性表達的col12a1a共定位（圖4e），證實了瞬時col11a1a和col12a1a成纖維細胞為心外膜或心外膜衍生成纖維細胞的起源。為了進一步闡明短暫心外膜成纖維細胞狀態的起源，作者應用了RNA速度分析方法，對心外膜譜系簇中所有心室細胞類型在3 d.p.i.和7 d.p.i.下的發育軌跡進行推斷（圖4f），得到了相同的結論。
圖4?心外膜成纖維細胞的鑒定
5. 心內膜成纖維細胞的鑒定
瞬時nppc成纖維細胞和其他幾個成纖維細胞亞型(spock3、cfd和瓣膜成纖維細胞)在3 d.p.i.或7 d.p.i.時不屬于心外膜譜系，但與心內膜以及彼此之間顯示中度正相關。基于相關性的分析有一個潛在的假設，即所有克隆體都會表現出相似的轉換率（圖5a），但是這種假設并不適用于所有細胞類型，于是作者引入條件概率開發了第二種算法（圖5b）。在3 d.p.i.時，不同成纖維細胞類型：col11a1a成纖維細胞、構成型成纖維細胞、心外膜(心室)轉變為col12a1a成纖維細胞類型的條件概率均大于0.9（圖5c）。在7 d.p.i. 時，不同的心內膜細胞類型：心內膜（心房）、心內膜（心室）和心內膜 ( frzb )轉變為nppc成纖維細胞的條件概率均大于0.8，表明這種成纖維細胞類型與心內膜之間存在譜系關系。為了驗證算法的真實性，作者構建了轉基因系Tg(fli1:Cre-ERT2; hsp70l:Switch)。在7 d.p.i.表達的EGFP與內源性表達的nppc共定位（圖5e），證實了瞬時nppc成纖維細胞的心內膜起源。RNA速度分析揭示了心室內膜和nppc成纖維細胞之間的轉錄相似性和潛在的過渡路徑（圖5f）。從單細胞轉錄組數據中觀察到，與健康對照組心臟相比，心內膜在7 d.p.i.時發生了激活反應（圖5g）。
圖5?心內膜成纖維細胞的鑒定
6. 典型Wnt信號通路作用的細胞解剖
作者發現成纖維細胞中表達了許多與Wnt信號有關的基因(配體、受體和調節劑)（圖6a），于是這啟發了他們去研究Wnt信號在斑馬魚心臟再生過程中的作用。一方面，Wnt通常被認為是一種促增殖因子，Wnt的激活已被證明對斑馬魚鰭和脊髓再生有益。另一方面，Wnt信號通路在心肌細胞去分化和增殖中的作用存在爭議。于是，作者在斑馬魚心臟冷凍損傷后，使用特征良好的Wnt/β-catenin依賴的信號抑制劑IWR-1抑制典型的Wnt信號，并在3,7,15和30 d.p.i.觀察其影響。結果發現，Wnt/β-catenin信號通路抑制導致心臟再生顯著延遲，與對照組相比，心肌纖維化延長，損傷面積增大（圖6b）。IWR-1處理后心臟的單細胞轉錄組數據顯示心肌細胞去分化延遲，與對照組相比，去分化心肌細胞數量在3 d.p.i.時減少，而在7 d.p.i.時未定位于損傷區域（圖6c）。Wnt抑制后，血管周細胞和所有心內膜成纖維細胞(nppc、spock3和瓣膜成纖維細胞)的水平顯著降低，而其他短暫增加的成纖維細胞總體上保持在類似水平（圖6d）。通過熒光原位雜交也證實了，Wnt信號對于心內膜成纖維細胞的激活是必需的，類似于所描述的Wnt在誘導小鼠內皮細胞向間充質細胞轉化中的作用。
為了評估血管再生，作者對4d.p.i.下冠脈內皮細胞(cECs)的增殖以及7 d.p.i.損傷區冠狀動脈的覆蓋范圍進行了定量分析。發現注射IWR-1后，cEC增殖在4 d.p.i.時有邊緣但不顯著的下降（圖6f,g）。然而，在7d.p.i.時，損傷區冠狀動脈覆蓋明顯減少（圖6h,j）。這些結果表明，Wnt抑制后觀察到的心臟再生減少至少部分是由血管再生缺陷介導的。這種缺陷似乎不是由cECs增殖減少引起的，而可能與血管再生的其他方面有關。
圖6 對典型Wnt信號作用的細胞剖析
總? 結
成年斑馬魚心臟損傷后具有很高的再生能力。然而，再生生態位的組成在很大程度上仍然難以捉摸。這篇文章基于單細胞轉錄組學和時空分析，解剖了再生斑馬魚心臟中激活細胞狀態的多樣性。觀察到損傷后出現的幾種具有成纖維細胞特征的瞬時細胞狀態，并概述了表達膠原-12的成纖維細胞的促再生功能。為了了解導致心臟再生的級聯事件，作者通過高通量譜系追蹤確定了這些細胞狀態的起源。最終發現激活的成纖維細胞有兩個不同的來源:心外膜和心內膜。在機制上，確定Wnt信號作為心內膜成纖維細胞反應的調節器。總之，本文確定了促進心臟再生的特殊活化成纖維細胞狀態，從而為調節脊椎動物心臟再生能力開辟了可能的途徑。
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