1、前言

1.1適用范圍

本指南介紹百邁客動物類組織&核酸樣品的送樣要求及制備方法。采集送樣前請詳細閱讀。信息單中樣本名稱、組織部位必須與實物相符，避免因信息單與實物不符導致反復核對，影響樣本質量、錄入周期，導致提取核酸質量不滿足建庫測序要求，實驗周期過長等

1.2提取風險提示

核酸提取質量與物種及組織部位、樣本制備、樣本交接、提取方法與操作、以及環境等因素息息相關，尤其是三代超長提取對樣的要求更高。組織提取時可能受到上下游處理操作的影響，因此較難保證單次提取滿足質量要求，望老師知悉理解，并做好組織備份。為保障獲得相對較高質量的核酸，請老師務必按照以下指導原則準備樣本。對于珍貴樣本或微量樣本，建議自行提取

2、組織送樣量要求

注意：未在表格出現的物種，請單獨溝通。送樣量結果展示為滿足提取一次的量，如樣品經過特殊處理或樣本狀態異常有幾率影響得率，為了保證您的實驗可以順利進行，請酌情增加送樣量

2.1常規植物組織送樣要求

3、核酸送樣要求

1)核酸送樣需要提供相關檢測結果，DNA類核酸可提供以下檢測手段中的一種或多種檢測結果： Qubit、 NanoDrop、 AGE，同時請采取適當的純化方法，以避免多糖、多酚、蛋白或者核酸酶對DNA樣品的污染，并詳細注明溶解DNA所使用的溶解液類型

2)如果您開展的實驗項目為miRNA的相關實驗，并且提供的是總RNA的樣本，請務必確認您采用的總RNA的提取方法保留了小RNA （ 包括miRNA），提取試劑盒型號備注送樣信息單中

3.1二代DNA送樣量要求

3.2三代DNA送樣量要求

3.3RNA類送樣量要求

1)針對核酸有雜質、污染、粘稠、顏色等情況，需要過柱純化后送樣或者酌情增加送樣量

2)核酸樣品建議使用1.5ml、2ml EP管裝載樣品，其他保存管容易破裂且不利于保存樣品和后續實驗的開展

3)為了防止樣品污染和混淆，禁止使用96孔板和深孔板裝載樣品

4)用乙醇沉淀的樣品由于運輸中會有少量乙醇揮發，建議將樣品管蓋用封口膜纏繞4-5圈

5)考慮到核酸可能存在含有雜質、顏色等物質導致會產生大量損失的風險，為保證樣本一次檢測合格并節約寶貴的重送樣時間，送樣建議量是高于公司判定標準的，請在核酸量足夠的前提下盡量按照送樣建議來送樣

4、樣品制備保存指南

4.1常規植物類樣本（不含藻類）制備流程

由于老葉或其它組織DNA&RNA含量可能較低，而次生代謝物含量一般相對較高，因此，為降低DNA&RNA提取難度并減少污染物干擾，請盡量選擇健康、幼嫩的葉片組織；不建議選擇易帶有寄生或共生生物的組織，以及不易清洗和研磨的根、莖等組織致密的器官。另外藻類組織中的水分會影響提取得率，取樣時需將組織樣中的水分吸干。建議在采集樣本之前，將樣本置于黑暗環境24-48小時后再制備樣本（停止光合作用，減少代謝干擾），新鮮組織樣采樣流程如下：

1)用清水將材料表面的灰塵及泥土沖洗干凈，吸干，再從植物體上取下新鮮組織（注：如果是需要進行處理，請在活體上進行處理后再取樣

2)如果組織體積較大，將組織剪切成 50-100 mg小塊,約黃豆大小的小塊,放入提前準備好的凍存管中

3)處理好的組織樣本混合均勻后立即保存于提前標記編號、液氮預冷的2 mL 或更大體積的旋蓋凍存管中，根據組織樣本量選擇核酸凍存管

4)液氮凍存前將樣品分割成 50~100 mg 左右的小塊，處理好的組織樣本混合均勻后保存于提前標記編號、液氮預冷的2 mL 或更大體積的旋蓋凍存管中，根據組織樣本量選擇核酸凍存管

5)迅速置于液氮中冷凍 1~2 h，然后按照順序依次放入樣品盒中（不建議自封袋送樣），轉移至-80 °C長期保存（禁止亂放，尤其是項目中樣品個數較多時），干冰運輸

注：植物組織不建議使用組織保護液保存。對于一些需要剝去種皮處理的，因樣品速凍后無法準確剔除，如有需要剝去種皮的老師須自行操作

4.2Ultra Long ONT類植物樣本

4.2.1植物組織選取及取樣步驟

1)準備剪刀、鑷子、錫箔紙，選取新鮮幼嫩的組織， 例如幼嫩的葉片（也可以是新長出的幼嫩根尖）

2)除去枯萎的，損傷的部分，除去莖，葉柄和粗的葉脈

3)將組織清理干凈，可放在容器中用水沖洗，除去雜質和其他殘余碎片

4)將清洗干凈的樣本倒在吸水紙上，再蓋上一張吸水紙用手輕輕壓幾次（注意不要太用力損傷 葉片），水盡可能除去

5)將葉片稱量一下，每0.5g/管（推薦使用 50ml 離心管）裝好，標注樣本名稱，日期，準確重量

6)放入液氮快速冷凍 10min，轉入-80 °C 冰箱保存，干冰運輸

7)葉片剪下后的稱量等操作，請在 10min 內完成，時間過長會導致葉片失水不可用，部分地區氣溫較高失水更快，操作時間需更短

4.2.2注意事項與說明

1)葉片要幼嫩的、新鮮的 、完整的（不要有損傷），可用手對比老葉和嫩葉的觸感，嫩葉的觸感非常柔軟

2)林木 、灌木類的請根據生長周期來確定采樣時間， 最好是發芽后長出來的嫩葉

3)禾本科黃化苗 1-2 周，最好有專門的黃化經驗，黃化太過會造成細胞核難提取 。如果不會黃化就送 1-2 周剛長出來的葉片，具體生長時間需根據植物的生長狀態判斷

4)組培苗，不建議直接使用，盡量移植到土壤中培育出植株，取新長出的幼嫩葉片，若使用組培苗送樣，請客戶多準備備份樣本

5)送樣前請拍照記錄樣品狀態

5、注意事項

核酸提取質量與物種及組織部位、采集方法及保存狀態、提取方法及操作、實驗器材及環境等因素均有密不可分的聯系，尤其是三代超長提取對樣本的質量、總量要求更高，望知悉及理解，并做好樣本備份。為了保障獲得高質量的核酸，請務必按照送樣手冊所規定的準備樣本。對珍貴樣本或者微量樣本，建議自行提取

1)組織速凍時間：組織離體后，胞內核酸便開始降解，尤其是 RNA，故采集時，目的組織離體后，需立即速凍，建議 3min 內完成，越快越好。速凍時間過短會導致速凍不徹底，核酸有降解風險

2)組織送樣量：建議送樣量適用于 95%的物種組織，少部分組織因胞內核酸量較低，需適當增加送樣量，比如動物皮膚、毛發等。請嚴格按照上方組織送樣量要求送樣，送樣量過少或過多均不利于提取實驗。采樣量較少會導致提取的核酸總量、濃度不合格，采樣量過多反而會造成速凍不徹底、提取取樣困難、凍融降解等危險

3)組織狀態：不建議送組織狀態差或非生長旺盛期樣品，核酸有一定幾率降解

4)組織保存管的選擇：所有組織樣品務必使用離心管或螺紋管保存，切勿直接裝入密封袋（低溫凍脆易破裂，導致樣品泄露，交叉污染）保存

5)組織樣品保存方法選擇：首選液氮速凍；沒有液氮條件的，可直接放入-80℃冰箱凍存。未使用液氮速凍或液氮速凍時間過短都有一定幾率導致核酸降解

6)組織送樣方式的選擇：干冰運輸，且需要保證干冰的充足，冰袋和常溫送樣，有幾率導致核酸的降解。除RNA類樣品可使用RNAlater保存送樣，其余產品均建議送速凍組織，不建議使用保護液送樣，化開離心會有幾率導致核酸降解；不建議酒精送樣，固定不徹底，有一定幾率殘留核酸酶，降解核酸

7)凍融組織： 組織凍存后，一旦凍融，核酸降解概率大于 80%，幾乎不可能提取成功，此類組織不建議送樣。請各位老師送樣前注意組織保存狀態， 確保組織未發生過凍融情況

8)帶血組織：由于血液沒有專業的保護劑，去除不凈一起速凍送樣會影響組織的完整性

9)長年保存的組織：保存時間超過一年的組織不建議送樣

10)組織分離要求：正常組織樣本中不能含有病變組織，而病變組織樣本中也不可以夾帶有正常組織，提取實驗時無法精確取樣，無法稱重。組織量過多的不能全部取樣，只隨機選取適量組織提取

11)對于同一個組織樣品需要同時提取 DNA和 RNA 的，請務必分成兩管分批次送樣。樣本的特殊處理包括：鹽處理、溫度處理、藥物處理、病毒侵染、傷害處理、干旱處理等脅迫處理方式，不同程度的處理對樣本的核酸質量會造成不同程度的影響，常見的會導致核酸 的降解或者得率降低。因此，經過特殊處理的樣本，在送樣時，務必請在樣本信息單中進行詳細的備注，以便盡量提高提取的成功率和避免樣本的浪費

6、不合格樣品存在風險

6.1樣本總量不足、濃度過低存在風險

1)文庫構建失敗

2)文庫產量低不能上機測序或測序數據量不足

3)導致數據隨機性異常

4)數據質量差

6.2降解樣本風險

1)文庫構建失敗

2)文庫產量低不能上機測序或測序數據量不足

3)導致數據隨機性異常

4)數據質量差

5)導致數據duplication比例高、隨機性差

6)導致Small RNA rRNA比例高，影響有效數據，文庫片段異常

6.3蛋白或其他雜質污染

1)可能影響Small RNA電泳分離，造成切膠不準，影響問題質量

2)可能影響RNA-seq磁珠分離導致建庫失敗，或即使達到上機要求也可能導致文庫隨機性差等問題

3)文庫構建失敗

4)文庫產量低不能上機測序或測序數據量不足

6.4目標RNA含量低

1)總RNA達到要求，但由于樣本特異性，small RNA含量低于正常樣本，導致建庫失敗

2)總RNA達到要求，但由于處理或組織部位的特異性，mRNA降解或含量低，導致建庫失敗或者測序數據中rRNA 數據比例高